Pertenecía a una familia descendiente de los colonos del Mayflower y hasta tenía sangre real en sus venas. Su padre era ginecólogo y fue el que la educó. Su madre, Katharine Houghton, era una decidida sufragista muy activa en su comunidad y que luchó por el reconocimiento de las prostitutas. Hepburn se crió en un ambiente libre y tolerante, lo cual marcaría su carácter. Practicó desde muy pequeña muchos deportes, y según cuenta en su autobiografía, un verano se cortó el pelo y se hizo llamar Jimmy, y según se define ella misma, fue un «marimacho».
Siendo muy joven, recibió un duro golpe: su hermano Tom de 14 años, a quien ella estaba muy unida, se suicidó ahorcándose en Nueva York durante una visita a un familiar: esto la convirtió en una joven retraída y poco comunicativa. Dejó los estudios en la escuela y da clases con su madre en su casa.
Inició sus estudios de Filosofia en el Bryn Mawr College, lugar donde comenzó sus actuaciones teatrales. Cuando los terminó en 1928 decidió dedicarse de lleno a la interpretación. Tuvo pequeños papeles en obras como La Zarina donde hizo un reemplazo y viajó a Nueva York, donde tomó clases de dicción con la antigua cantante Frances Robinson Duff. En 1932 tuvo un enorme éxito con la obra teatral The warrior's husband, una fábula griega. Ese mismo año fue requerida por el cine y protagonizó para la RKO la película Doble sacrificio, junto a John Barrymore, dirigida por quien llegaría a ser uno de sus más íntimos amigos, George Cukor.
Protagonizó Hacia las alturas en la que interpreta a una piloto, muy inspirada en la figura de Amelia Earhart. En 1933 gana su primer Óscar por interpretar a una actriz provinciana que va a buscar gloria en la gran ciudad, en Gloria de un día. En 1934 gana el premio a la mejor actriz en el Festival de Cine de Venecia por su interpretación en Mujercitas/Las cuatro hermanitas, donde interpretó a Jo March, en la versión de George Cukor del clásico Mujercitas.
